近年來，隨著國內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)規(guī)模不斷擴大，呼吸道疾病的危害日趨嚴(yán)重，而且混合感染現(xiàn)象頻發(fā)，臨床上難以區(qū)分。其中禽傳染性支氣管炎和H9亞型禽流感仍是危害肉雞的主要呼吸道疾病。禽傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是套式病毒目、冠狀病毒科、γ冠狀病毒屬成員，全長大約有27.6 kb，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，感染宿主后可以引起禽傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis,IB)[1,2]。IB是一種急性、高度接觸性的呼吸道疾病，主要侵害宿主的呼吸、消化和泌尿系統(tǒng)[3]。目前發(fā)現(xiàn)的基因型有GI～GⅦ7個亞型，亞型又有三十多個分型，目前國內(nèi)主流基因型有GI-1、GI-7、GI-13、GI-19和GI-22等[4]。

禽流感（Avian Influenza,AI）是由正粘病毒科禽流感病毒（Avian Influenza virus,AIV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病[5]，分為高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza Virus,HPAIV）和低致病性禽流感（Low Pathogenic Avian Influenza Virus,LPAIV）。禽流感病毒根據(jù)血凝素(Hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)抗原性的差異分型，分為18個HA(H1～H18）亞型和11個NA(N1～N11）亞型[6]。目前流行的主要基因型有H9N2(LPAIV)、H7N9和H5N6(HPAIV),Liu等[7]對H9N2亞型創(chuàng)建了一種新型譜系劃分的方法，更有利于統(tǒng)計該基因型的流行情況。

2023年山東某雞場部分肉雞發(fā)生不同程度的呼吸困難，并伴有零星死亡，死亡雞剖檢可見氣管出血、支氣管栓塞、部分雞有尿酸鹽沉積。為探明其發(fā)病原因，實驗室對采集的病料優(yōu)先進行PCR快速診斷，然后進行病毒分離鑒定，進一步探索分離毒株主要基因的遺傳變異情況，為當(dāng)?shù)夭扇∮行У姆揽卮胧┨峁├碚撘罁?jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 毒株來源與發(fā)病情況

2023年6月，山東某養(yǎng)雞場飼養(yǎng)的20日齡肉雞陸續(xù)出現(xiàn)氣管啰音、咳嗽、呼吸困難等呼吸道癥狀，且陸續(xù)出現(xiàn)死亡，發(fā)病原因尚不清楚。

1.2 剖解變化

解剖病死雞，可見支氣管栓塞，部分雞腎臟有尿酸鹽沉積。

2 實驗室診斷

2.1 SPF雞胚與試劑

SPF雞胚購于山東昊泰實驗動物繁育有限公司；IBV、H9亞型AIV陽性血清由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所保存；Axy Prep體液病毒DNA/RNA試劑盒購于杭州AXYGEN公司；Onestep RT-PCR試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL 2000 DNA Marker購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；p MD18-T Vector Cloning Kit購自大連寶生物有限公司；Biospin膠回收和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Bio Flux公司。

2.2 病料處理及PCR檢測

取采集的氣管、支氣管、腎臟等病料加入5倍其體積的生理鹽水進行研磨，反復(fù)凍融3次后取出，8 000 r/min離心5 min，提取核酸，備用。使用IBV、H9亞型AIV、傳染性喉氣管炎（ILTV）和雞毒支原體（MG）等檢測引物對其進行PCR鑒定，根據(jù)檢測結(jié)果進行下一步試驗。

2.3 病毒分離與純化

將病料以9 000 r/min離心30 min取上清液，加5 000 U青鏈霉素充分作用，分別加入IBV和H9亞型AIV的陽性血清中和，作用30 min后分別將病毒液接種9日齡SPF雞胚，每組接種10個SPF雞胚；設(shè)陰性對照組，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每12 h照胚一次，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚。H9亞型AIV陽性血清中和組，48 h收獲1/2雞胚的尿囊液，進行PCR檢測；IBV陽性血清中和組，96 h收獲1/2雞胚的尿囊液，進行HA試驗；同時用H9陽性血清中和后進行HA試驗。剩余的雞胚培養(yǎng)至168 h，觀察雞胚變化。

2.4 分離株基因擴增及序列分析

利用實驗室設(shè)計的引物分別擴增分離病毒的S1基因和HA基因全長，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將含有目的條帶的純化產(chǎn)物送至青島擎科生物有限公司測序。采用DNASTAR軟件與Gen Bank中下載的參考株的IBV S1或H9亞型AIV HA基因序列進行比較分析。MEGA5.0軟件繪制進化樹，在線生物軟件Net NGlyc 1.0Server進行N-糖基化位點分析[8]，進一步分析IBV或H9亞型AIV分離毒株的遺傳變異情況。

3 結(jié)果

3.1 PCR鑒定結(jié)果

將提取的RNA模板用AIV通用、H9亞型-AIV、IBV、NDV（新城疫病毒）、MG、IBDV（傳染性法氏囊病毒）和ITLV等檢測引物進行檢測，檢測結(jié)果顯示AIV通用、H9亞型-AIV及IBV擴增出目的片段，分別為230、250 bp和470 bp，與預(yù)期片段大小一致（圖1），其他引物未見特異性條帶，說明該病料中可能存在著IBV和H9亞型AIV的混合感染。

3.2 病毒分離與雞胚接種

病料樣品分別接種SPF雞胚后，未出現(xiàn)雞胚死亡，其中H9亞型AIV陽性血清中和組收獲尿囊液PCR檢測為IBV陽性，命名為SDDZ/202301（簡稱DZ01）。繼續(xù)培養(yǎng)至168 h的雞胚發(fā)育矮小，且身體蜷縮為團狀，為IBV典型的侏儒胚；而IBV陽性血清中和組的雞胚正常，無明顯病變。

3.3 血凝試驗

將收獲的尿囊液進行HA試驗，H9亞型AIV陽性血清中和組收獲的尿囊液無HA效價，其血凝特性能被H9亞型AIV陽性血清中和掉；而IBV陽性血清中和組尿囊液對1%紅細胞的血凝效價為7 log2，其血凝特性能被H9亞型AIV陽性血清中和掉，進一步表明該分離毒為H9亞型AIV，命名為SDDZ/202302(DZ02）。

3.4 分離株進化樹和同源性分析

以分離毒RNA為模板，分別用AIV-H9 HA F/R和IBV-S1 F/R兩對引物進行RT-PCR擴增，擴增片段大小分別約為1 676 bp和1 629 bp（圖2）?；厥漳康钠慰寺≈羛 MD18-T載體，送青島擎科生物有限公司測序。

DZ01 S1基因核苷酸（氨基酸）同源性分析結(jié)果顯示，DZ01與所有參考株的核苷酸和氨基酸同源性分別是60.2%～96.7%和50.3%～95.6%,其中與GI-19(LX4）同源性最高，分別為96.7%和95.6%；蛋白裂解位點為HRRRR，與GI-19型參考株一致。與疫苗株GI-1、GI-13和GI-22的核苷酸（氨基酸）同源性分別為77.2%(76.8%),78.3%(78.9%）和80.4%(78.3%）?；赟1基因構(gòu)建的進化樹（圖3），顯示DZ01分離株與GI-19(LX4）屬于同一分支，親緣關(guān)系最近，說明DZ01未發(fā)生明顯變異，仍屬于當(dāng)前流行的優(yōu)勢IBV。

DZ02與所有AIV-H9參考株的核苷酸和氨基酸同源性為78.1%～95.1%和79.4%～94.2%，而與2017、2018、2019年和2022年毒株核苷酸（氨基酸）同源性分別為91.3%～93%(92.1%～94.1%）、91.1%～92.9%(91.8%～94.2%）、89.6%～92.7%(92.3%～94.1%）和93.1%～95.1%(92.2%～93.4%）?；贖A基因構(gòu)建的進化樹（圖4），顯示DZ02與實驗室2017～2022年的大部分分離株親緣關(guān)系較近，均屬于H9.4.2.5分支，說明該地區(qū)分離株仍為主流基因型H9.4.2.5基因型。

3.5 分離株N-糖基化位點分析

DZ01與GI-19型參考株進行氨基酸對比分析后，發(fā)現(xiàn)有13個位點的氨基酸發(fā)生突變，分別是23(S）、65(G）、86(S）、140(F）、156～157(SR）、226(K）、275(A）、342(D）、422(T）、436(N）、486(P）、511(I），其中38～67位氨基酸突變位于S1基因高變區(qū)Ⅰ（HVRⅠ），91～141位氨基酸突變點位于HVRⅡ，第274～387氨基酸突變位點則位于HVRⅢ。糖基化位點分析結(jié)果顯示DZ02具有15個N-糖基化位點，與參考株GI-19(LX4）相比較在141位點（NGS）缺乏一個N-糖基化位點，其余位點均一致。DZ02糖基化位點分析結(jié)果顯示有8個N-糖基化位點，較參考株H9.4.2.5在495(NGS）位置少一個N-糖基化位點，其余位點相同。

4 討論

近年來，因肉雞規(guī)?；潭雀?、養(yǎng)殖密度大，呼吸道疾病呈高發(fā)趨勢。因呼吸道疾病導(dǎo)致雞群抵抗力下降后感染多種傳染病的情況也比較常見，混合感染使得雞群的病死率驟升，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[9]。張建軍等[10]曾報道IBV和AIV混合感染后導(dǎo)致呼吸道出現(xiàn)炎性滲出物并堵塞支氣管。我們報道的病例也出現(xiàn)了支氣管的栓塞，結(jié)合實驗室PCR診斷、病原分離鑒定及測序分析，明確該病例為IBV(GI-19型）和AIV-H9(H9.4.2.5分支)混合感染。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，IBV分離株DZ01盡管與GI-19型親緣距離最近，屬于同一基因型，但其S1基因發(fā)生了13個氨基酸的突變，其中高變區(qū)Ⅰ（HVRⅠ）有1個突變，HVRⅡ有1個突變，HVRⅢ有2個突變。這些氨基酸位點的突變是否與其致病性的改變有關(guān)值得去關(guān)注。此外，Zheng等[11]研究發(fā)現(xiàn)IBV在不同位置的N-糖基化位點可能對S蛋白介導(dǎo)的融合、病毒感染性和復(fù)制性產(chǎn)生不同的影響。高緒慧等[12]在對山東地區(qū)流行的17株H9N2毒株基因組遺傳進化分析時，曾推測潛在的糖基化位點可能會影響致病性。而在本研究中，DZ01株較GI-19型參考株在141位點（NGS）少一個位點，DZ02較H9.4.2.5參考株在495(NGS）位置少一個N-糖基化位點，分離毒株的基化位點改變是否對病毒致病性和抗原性有影響需要進一步探索。

傳染性支氣管炎病毒和H9亞型禽流感病毒均屬于條件性病原，一旦出現(xiàn)環(huán)境應(yīng)激、飼養(yǎng)條件改變等影響，雞群感染這兩種病的概率就會大大增加。因此，養(yǎng)殖場管理者要不斷提升飼養(yǎng)管理水平，加強生物安全意識，如有發(fā)病跡象，及時進行實驗室確診，迅速采取措施，降低經(jīng)濟損失。

疫苗接種仍是預(yù)防雞傳染性支氣管炎和H9亞型禽流感的重要措施，因此，養(yǎng)殖企業(yè)要密切關(guān)注當(dāng)?shù)囟局甑牧餍鞋F(xiàn)狀，有針對性地調(diào)整免疫程序，加強抗體的監(jiān)測，掌握雞群的免疫效果，做到科學(xué)防控。